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生物化学

糖皮质激素

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由于仪器,实验方法和计算搜索算法的进步,糖皮质激素学已经成熟。

糖基化是最常见的翻译后修饰之一,糖蛋白在重要的生物过程(例如细胞信号传导,宿主与病原体的相互作用,免疫应答和疾病,包括癌症,甚至正在进行的COVID-19大流行)中起着至关重要的作用(科学研究 369,330–333,2020)。 糖皮质激素学旨在确定给定细胞或组织中聚糖和糖基化蛋白质的完整组成部分的位置和身份。

聚糖无处不在。 高通量糖蛋白组学方法提供了见识。 图片来源:Springer Nature的Katherine Vicari

基于质谱(MS)的方法可以进行大规模的全局分析; 然而,聚糖的结构多样性和糖基化位点的异质性使综合分析特别具有挑战性。 聚糖阻碍了蛋白质骨架的完整片段化,为了简化起见,传统上将它们去除是为了丢失聚糖信息。 由于存在异构体,MS质谱图趋于复杂,通常需要手动解释。 此外,寻找光谱匹配的数据库可能很快成为一个组合问题,并需要创新的生物信息学解决方案。

MS仪器,碎片化策略的最新发展(J.蛋白质组研究. 19,3286–3301,2020)和高通量的工作流程使分析完整糖蛋白成为可能。 几种特定的富集策略甚至可以检测低丰度的聚糖和糖肽(大声笑细胞。 蛋白质组学 https://doi.org/10.1074/mcp.R120.002277(2020年)。 已经开发出了多种针对蛋白质或蛋白质的共有位点的N-连接聚糖或没有可识别的共有序列的O-连接聚糖量身定制的实验工作流程(自然 549,538–542,2017; 纳特。 COMMUN。 115268,2020; 纳特。 方法 16,902–910,2019)。 基于片段离子索引策略的新软件包可大幅提高糖肽和位点分配的速度(纳特。 方法 17,1125–1132,2020; 纳特。 方法 17,1133–1138,2020).

近年来,随着其他组学领域的关注最大,现在是糖蛋白组学大放异彩的时候了。 对不同粒度的糖基化的全面理解必将为基础研究和转化研究提供服务。

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对应 阿鲁尼玛·辛格(Arunima Singh).

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辛格,A。糖皮质激素学。 纳特方法 18, 28 (2021). https://doi.org/10.1038/s41592-020-01028-9

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资料来源:https://www.nature.com/articles/s41592-020-01028-9

生物化学

糖皮质激素结合粘附受体GPR97–Go复合物的结构

由柏拉图重新发布

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没有使用统计方法来确定样本量。 实验不是随机的,研究人员在实验和结果评估过程中也不会盲目分配。

细胞系

HEK293细胞获自上海生物科学研究所细胞资源中心(中国科学院)。 草地夜蛾 (Sf9)细胞购自Expression Systems(目录94-001S)。 Y-1细胞最初是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的。 使细胞在含有1640%FBS(Gibco)的RPMI 10中于37°C在包含5%CO的潮湿气氛中单层培养2 和95%的空气。

GPR97和miniGo异源三聚体的构建

为了在昆虫细胞中产生蛋白质,将具有自蛋白水解基序突变(H97 / A和T21 / A)的人GPR549(248-250位残基)亚克隆到pFastBac1载体中。 用血凝素信号肽(HA)替换天然信号肽以增强受体表达,然后用Flag标签DYKDDDK(中国肽)促进复杂的纯化。 工程人类Gαo1 与Gαo1 H结构域缺失,命名为miniGαo1 根据公开文献将其克隆到pFastBac1中29。 将具有C端六组氨酸标签的人Gβ1和人Gγ2亚克隆到pFastBacDual载体中。 将scFv16克隆到具有C端六组氨酸标签和N端GP1信号肽的pfastBac67中。 要检查GPR97,GPR97-FL-WT(野生型全长GPR97),GPR97-FL-AA(GPR97 GPS位点突变,H248 / A和T250 / A),GPR97β(已去除NTF的GPR97)的活性,残基250-549)和GPR97-β-T(去除了N末端拴系的Stachel序列的GPR97β,残基265-549)被亚克隆到pcDNA3.1质粒中。 使用Quikchange诱变试剂盒(Stratagene)产生GPR97突变E298A,R299A,F345A,F353A,H362A,L363A,Y364A,V370A,F371A,Y406A,W421A,W490A,A493G,I494A,L498A和N510A。 G蛋白BRET探针是根据以前的出版物构建的42,43。 人G蛋白亚基(Gαq,Gβ1和Gγ2)亚克隆到pcDNA3.1表达载体中。 Gαq-RlucII亚基是通过将RlucII的编码序列扩增并插入到Gα中而产生的q 在残基L97和K98之间。 Gqo 探针,其中GαC端的六个氨基酸q-RlucII被Gα取代o1通过使用编码交换的C-末端序列的合成寡核苷酸通过PCR扩增来构建RNAi。 GFP10–Gγ2质粒是通过将GFP10编码序列在N末端的框内融合至Gγ2而产生的。 通过DNA测序验证所有的构建体和突变。

蛋白表达

使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统生成高滴度的重组杆状病毒。 简而言之,将2μg重组杆粒和2μlX-tremGENE HP转染试剂(Roche)在100μlOpti-MEM培养基(Gibco)中混合,并在室温下孵育20分钟。 将转染溶液添加到2.5 ml Sf9细胞中,密度为1×106 每毫升在24孔板中。 将感染的细胞在摇床上于27°C培养4天。 收集P0病毒,然后扩增以产生P1病毒。 通过流式细胞术分析用gp64-PE抗体染色的细胞(1:200稀释; 12-6991-82,Thermo Fisher)确定病毒滴度。 然后,用编码GPR9-FL-AA,miniGα的病毒感染Sf97细胞o,Gβγ和有或没有scFv16的感染复数相等。 收集之前,将感染的细胞在27°C,110 rpm下培养48小时。 最后通过离心收集细胞,并将细胞沉淀保存在-80°C。

GPR97–Go 复合物的形成和纯化

转染了GPR97-FL-AA,miniGo三聚体和scFv16的病毒的细胞沉淀(仅存在于用于纯化皮质醇–GPR97-FL-AA–G的细胞沉淀中o–scFv16复合物)重悬于20 mM HEPES,pH 7.4、100 mM NaCl,10%甘油,10 mM MgCl2 和5 mM CaCl2 补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(B14001,Bimake)和100μMTCEP(Thermo Fisher Scientific)。 通过在室温下加入2μMBCM(HY-B10,MedChemExpress)或皮质醇(HY-N1540,MedChemExpress),0583 mU / ml腺苷三磷酸腺苷(Sigma)形成复合物25小时,然后以0.5%(w / v)月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG; Anatrace)和0.1%(w / v)胆固醇半琥珀酸酯TRIS盐(CHS; Anatrace)在2°C下放置4 h。 通过以30,000 rpm离心40分钟收集上清液,并将溶解的复合物与镍树脂在2°C孵育4小时。 收集树脂并用20柱体积的20 mM HEPES,pH 7.4、100 mM NaCl,10%甘油,2 mM MgCl洗涤2,25 mM咪唑,0.01%(w / v)LMNG,0.01%GDN(Anatrace),0.004%(w / v)CHS,10μMBCM(或皮质醇)和100μMTCEP。 用20 mM HEPES,pH 7.4、100 mM NaCl,10%甘油,2 mM MgCl洗脱复合物2,200 mM咪唑,0.01%(w / v)LMNG,0.01%GDN,0.004%(w / v)CHS,10μMBCM(或皮质醇)和100μMTCEP。 将镍树脂的洗脱液应用到M1抗-Flag树脂(Sigma)中2小时,并用20 mM HEPES,pH 7.4、100 mM NaCl,10%甘油,2 mM MgCl洗涤2,5 mM CaCl2,0.01%(w / v)LMNG,0.01%GDN,0.004%(w / v)CHS,10μMBCM(或皮质醇)和100μMTCEP。 GPR97–Go 将复合物在含有20 mM HEPES,pH 7.4、100 mM NaCl,10%甘油,2 mM MgCl的缓冲液中洗脱2,0.01%(w / v)LMNG,0.01%GDN,0.004%(w / v)CHS,10μMBCM(或皮质醇),100μMTCEP,5 mM EGTA和0.2 mg / ml Flag肽。 将复合物浓缩,然后注入Superdex 200增加的10/300 GL柱中,该柱在含20 mM HEPES,pH 7.4、100 mM NaCl,2 mM MgCl的缓冲液中平衡2,0.00075%(w / v)LMNG,0.00025%GDN,0.0002%(w / v)CHS,10μMBCM(或皮质醇)和100μMTCEP。 收集复杂的级分并分别浓缩以用于EM实验。

Cryo-EM网格准备和数据收集

为了制备冷冻-EM栅格,需加入3μl纯化的BCM结合和皮质醇结合的GPR97–Go 将约20 mg / ml的复合物施加到辉光放电的多孔碳网格上(Quantifoil R1.2 / 1.3)。 使用Vitrobot Mark IV(Thermo Fisher Scientific)在通过液氮冷却的液态乙烷中将网格骤冷。 在浙江大学低温电子显微镜中心,以Titan Krios在300 kV加速电压下进行了低温EM成像。 使用Gatan K2 Summit直接电子检测器以计数模式记录显微照片,标称放大倍数为×29,000,对应于1.014Å的像素大小。 使用serialEM以约7.8个电子/Å的剂量率获得电影2 每秒的散焦范围为-0.5至-2.5μm。 总曝光时间为8 s,以0.2 s的间隔记录中间帧,导致每Å累积电子62个2 每张显微照片共有40帧。 对于结合BCM和皮质醇的GPR2,707-G,总共收集了5,871和97部电影o 复杂。

低温电磁数据处理

BCM–GPR97–G的剂量分割图像堆栈o 使用MotionCor2.1对复合体进行梁诱发的运动校正44。 每个非剂量加权显微照片的对比度传递函数(CTF)参数由Gctf确定45。 BCM–GPR2–G的粒子选择,3D和97D分类o 使用RELION-2.028-beta3.0对像素大小为2Å的合并数据集执行复合操作46.

对于BCM–GPR97–Go 复杂的半自动粒子选择产生了2,026,926个粒子投影。 对该投影进行了无参考2D分类,以丢弃定义不明确的类别中的粒子,从而生成911,519粒子投影以进行进一步处理。 5-HT的地图1BR–miniGo复合体(EMDB-4358)47 低通滤波到40Å被用作基于最大似然的3D分类的参考模型,从而得到一个具有307,700个投影的明确定义的子集。 进一步将对齐方式集中在复合物上的3D分类产生了占166,116个粒子的两个良好子集,这些子集随后进行了3D细化,CTF细化和贝叶斯抛光。 最终的细化生成了一个映射图,该图的指示全局分辨率为3.1Å,傅立叶壳相关系数为0.143。

对于皮质醇–GPR97–Go 复杂的粒子选择产生了4,323,518个粒子投影,用于无参考2D分类。 使用结合BCM的复合体图作为参考,为第二轮2,201,933D分类选择了具有3个粒子投影的定义明确的类。 选择了一个占335,552个粒子投影的良好子集进行另外两轮3D分类,将对齐方式集中在复合体上,并生成了一个包含75,814个粒子投影的高质量子集。 随后,对最终的粒子投影进行3D精修,CTF精修和贝叶斯抛光,从而生成具有2.9Å全局分辨率的地图。 两个密度图的局部分辨率是使用Bsoft软件包确定的,其中半图为输入图48.

模型建立与完善

对于BCM–GPR97–G的结构o 复杂,GPR97的初始模板是使用PHENIX中的“映射到模型”模块生成的44。 5-HT的坐标1BR–Go 复合体(PDB ID:6G79)用于生成G的初始模型o (参考文献。 44)。 使用UCSF Chimera将模型对接到EM密度图中49,然后在COOT中进行迭代的手动重建50 根据侧链密度。 使用phenix.elbow生成BCM和脂质坐标以及几何约束。 BCM是使用PHENIX中的“ LigandFit”模块为模型构建的。 BCM的位置显示出0.81的相关系数,表明该配体与密度相符。 使用Rosetta对模型进行进一步的实际空间优化51 和凤凰44.

对于皮质醇–GPR97–G的结构o 复数,GPR97和G的坐标o 来自BCM结合复合物和来自人类NTSR16-G的scFv1i1 复杂模型(PDB ID:6OS9)被用作初始模型。 将模型停靠在密度图中,然后在COOT中手动重建。 如所述,使用“ LigandFit”模块将激动剂皮质醇建立到模型中,显示出良好的密度拟合,相关系数为0.80。 使用Rosetta对模型进行了进一步完善51 和凤凰44。 使用PHENIX中的模块“全面验证(cryo-EM)”验证了两种结构的最终精炼统计数据44。 使用全局模型对图FSC(扩展数据图XNUMX)对两种结构都执行了模型对图的拟合优度。 2)。 扩展数据表中提供了优化统计信息 1。 使用UCSF Chimera,UCSF ChimeraX生成结构图52 和PyMOL53.

BCM–GPR97和皮质醇–GPR97配合物的分子动力学模拟

根据PHENIX的LigandFit程序计算的BCM和皮质醇与受体GPR97的有利结合姿势,GPR97-激动剂复合物是两个GPR97-激动剂-mG的底物o 用于分子动力学模拟的复合物。 受体的取向通过膜中蛋白质的取向(OPM)数据库计算。 此后,整个系统由CHARM-GUI制备,并嵌入由200个1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)脂质的替代方法。 然后将膜系统溶剂化到补充有3 M NaCl的周期性TIP0.15P水箱中。 CHARMM36m Force Filed用于建模蛋白质分子,CHARMM36 Force Filed用于脂类和盐的建模,CHARMM General Force Field(CGenFF)用于建模激动剂分子BCM和皮质醇。

然后,使用共轭梯度算法将系统最小化10,000步,然后以310.13 kcal mol在1 K和200 atm加热和平衡10.0 ps - 1 Å - 2 NAMD 2.13软件中的谐波约束。 接下来是在2 K和310.13个atm分别进行1轮平衡5.0 ns的循环,其谐波抑制为2.5、1.0、0.5、0.1和XNUMX kcal mol - 1 Å - 2 按顺序。

使用Langevin恒温器和Nose-Hoover方法在NPT集合中以310.13 K和1 atm进行生产模拟,持续200 ns。 静电相互作用的计算使用的是12Å截止值的粒子网格Ewald(PME)方法。 在平衡和生产的最后阶段,5.0 kcal mol - 1 Å - 2 在GPR97的残留物(位于G的5Å以内)上放置谐波抑制物o 在BCM(或皮质醇)中–GPR97–Go 可以确保在没有G蛋白的情况下受体保持活性状态。 使用视觉分子动力学(VMD,版本1.9.3)对轨迹进行可视化和分析

Y-1细胞中的cAMP ELISA检测

Y-1细胞转染 Gpr97 siRNA(si-97,GUGCAGGGAAUGUCUUUAA)或对照siRNA(si-Con)48小时。 在无血清培养基中饥饿12小时后,用可的松(8 nM),福司可林(5μM)(Sigma-Aldrich)或对照载体进一步刺激细胞10分钟。 然后,将细胞用预冷的PBS洗涤0.1次,并以500:1的比例(w / v)悬浮在预冷的5 N HCl中,其中包含1μMIBMX。 1分钟后,以10:10的比例(v / v)用600 N NaOH中和样品。 将样品于XNUMX离心后收集上清液g 10分钟然后根据制造商的说明使用cAMP参数分析试剂盒(R&D Systems)准备上清液用于cAMP测定。 的 Gpr97 使用定量实时PCR进一步证实了在各种条件下的表达水平。

皮质酮测量

小鼠肾上腺皮质瘤细胞系Y-1细胞转染 Gpr97 siRNA(si-97)或对照siRNA(si-Con)48小时。 然后,将细胞用无血清培养基处理12小时。 之后,将可的松(16 nM)或ACTH(0.5μM)加入细胞中30分钟。 根据制造商的说明,收集细胞培养基的上清液用于通过ELISA的皮质酮测量。

定量实时PCR

使用标准TRIzol RNA分离方法提取细胞的总RNA。 使用Revertra Ace qPCR RT试剂盒(TOYOBO FSQ-101),根据制造商的规程,使用1.0μg每种样品进行逆转录和PCR实验。 使用FastStart Universal SYBR Green Master(Roche)在Light Cycler仪器(Bio-Rad)中进行实时定量PCR。 将同一样品中的mRNA水平标准化为GAPDH,然后与对照进行比较。 实验中使用的GPR97正向和反向引物是CAGTTTGGGACTGAGGGACC和GCCCACACTTGGTGAAACAC。 GAPDH的mRNA水平用作内部对照。 GAPDH的正向和反向引物是GCCTTCCGTGTTCCTACC和GCCTGCTTCACCACCTTC。

cAMP抑制试验

为了测量对不同GPR97构建体或突变体响应不同配体或组成活性对福斯高林诱导的cAMP积累的抑制作用,根据以前的出版物进行了GloSensor cAMP分析(Promega)12,13。 在六孔板中使用PEI将HEK293细胞与GloSensor和各种版本的GPR97或媒介(pcDNA3.1)质粒瞬时共转染。 在37°C下孵育24小时后,将转染的细胞接种到无血清DMEM培养基(Gibco)的96孔板中,并在24%CO中于37°C再孵育5小时。2 大气层。 将不同的配体溶解在DMSO(Sigma)中,使原液浓度达到10 mM,然后在配体刺激之前立即使用PBS溶液进行系列稀释。 将转染的细胞与50μl含GloSensor cAMP试剂(Promega)的无血清DMEM培养基预孵育。 在37°C下孵育2小时后,将不同浓度的配体添加到每个孔中,然后将毛喉素添加到1μM。 在EnVision多标记微孔板检测器(Perkin Elmer)上检查发光强度。

而Gqo 蛋白质激活BRET测定

根据以前的出版物,BCM双丙酸酯诱导的GPR97活性可以通过嵌合G来测量qo 蛋白质测定25。 Gqo BRET探针是通过替换G的C末端的六个氨基酸生成的q-RlucII与来自G的人1号,创建嵌合Gqo-RlucII亚基47。 GFP10连接到Gγ。 Gqo 如先前所述进行蛋白激活BRET测定54。 简而言之,将HEK293细胞与对照D2R和各种GPR97构建体(编码G的质粒)瞬时共转染qo BRET探针,在37%CO中于5°C孵育2 气氛48小时。 用PBS洗涤细胞两次,收集并重悬于含有25 mM HEPES,pH 7.4、140 mM NaCl,2.7 mM KCl,1 mM CaCl的缓冲液中2,12 mM NaHCO3,5.6毫米 d-葡萄糖,0.5 mM氯化镁2 和0.37 mM NaH2PO4。 将细胞以96–5×8的密度分配到10孔微孔板中4 每孔细胞用不同浓度的配体刺激。 布雷特2 使用Mithras LB10多模式阅读器(Berthold Technologies)添加底物腔肠素400a(5μM,Interchim)(Cayman)后,测量RLucII和GFP940之间的差。 布雷特2 计算信号为GFP10(510 nm)与RLucII(400 nm)的发射比。

通过ELISA测量受体细胞表面表达

为了评估野生型GPR97及其突变体的表达水平,在293孔板中使用PEI试剂将野生型和突变GPR97或载体(pcDNA3.1)瞬时转染HEK37细胞。 在18°C下孵育24小时后,将转染的细胞以10的密度接种到XNUMX孔板中5 每孔细胞数,并在37%CO中于5°C孵育2 气氛18小时。 然后将细胞固定在4%(w / v)多聚甲醛中,并在室温下用5%(w / v)BSA封闭。 将每个孔与200μl单克隆抗FLAG(F1804,Sigma-Aldrich)一抗在4°C下孵育过夜,然后孵育与辣根过氧化物缀合的第二山羊抗小鼠抗体(A-21235,Thermo Fisher)在室温下放置1小时。 洗涤后,加入200μl的3,3,5,5′,0.25,450′-四甲基联苯胺(TMB)溶液。 通过加入等体积的200 M HCl溶液淬灭反应,并使用TECAN(Infinite M97 Pro NanoQuant)发光计数器测量293 nm处的光密度。 为了确定不同GPR450构建体或突变体的组成活性,将不同浓度的所需质粒瞬时转染到HEKXNUMX细胞中,并测量在XNUMX nm处的吸光度。

FlAsH-BRET分析

用GPR293-FlAsH转染HEK97细胞后,将其接种在六孔板中,其中Nluc插入特定的N末端位点。 在BRET测定之前,将HEK293细胞用血清饥饿1小时。 然后将细胞消化,离心并重悬于500μlBRET缓冲液(25 mM HEPES,1 mM CaCl2,140 mM NaCl,2.7 mM KCl,0.9 mM MgCl2,0.37 mM NaH2PO4,5.5毫米 d葡萄糖和12 mM NaHCO3)。 以终浓度2μM添加FlAsH-EDT2.5,并在37°C下孵育60分钟。 随后,将HEK293细胞用BRET缓冲液洗涤,然后分配到黑墙透明底96孔板中,每孔约100,000个细胞。 用终浓度为10的BCM和皮质醇处理细胞 - 5 到10 - 11 然后加入腔肠素H,终浓度为5μM,然后立即检查荧光素酶(440–480 nm)和FlAsH(525–585 nm)的发射。 使用Berthold Technologies Tristar 3 LB 941荧光分光光度计计算BRET比率(发射增强的黄色荧光蛋白/发射Nluc)。 该程序已从先前描述的内容进行了修改34,55,56.

统计分析

使用GraphPad Prism进行了单向ANOVA测试,以评估各种版本的GPR97及其突变体之间在表达水平,效价或功效方面的统计学显着性。 对于所有实验,在各自的图例中均显示了基于来自三个独立实验的数据集计算得出的平均值的标准误差。

报告摘要

有关研究设计的更多信息,请参阅 自然研究报告摘要 与本文相关联。

资料来源:https://www.nature.com/articles/s41586-020-03083-w

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生物化学

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  • 资料来源:https://www.nature.com/articles/s41592-020-01021-2

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    生物化学

    螺旋酶样运动蛋白HelD回收RNA聚合酶依赖性转录复合物的分子基础

    由柏拉图重新发布

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    转录延伸复合物的结构测定

    枯草芽孢杆菌 是医学上和工业上重要的模型代表生物 厚壁菌门 基因组中G + C含量低的门。 尽管付出了巨大的努力,但迄今为止,尚未确定来自低G + C革兰氏阳性菌的RNAP的结构。 RNAP核心(α2ββω)被纯化(补充图。 1),并使用HelD依赖性刺激进行多轮转录测定来确定其活性,该结果与先前研究中观察到的结果相同12 (图。 1a)。 然后,我们使用cryo-EM来确定 枯草芽孢杆菌 RNA转录延伸复合物(EC)在3.36Å处,有助于理解转录复合物回收过程中HelD引起的构象变化(图。 1b,c,表 1; 补充图 2,电影 1)。 RNAP 厚壁菌门 是最小的多亚基聚合酶17,18,并考虑到这组细菌的工业和临床重要性,该复合物将成为宝贵的参考结构。

    图1:RNAP延伸复合物的结构。
    figure1

    a 左图显示了纯化的RNAP核心的多轮转录测定法,其中补充了递增量的HelD(与RNAP的比率),仅HelD(0:32,阴性对照)和从中纯化的天然RNAP-HelD复合物 枯草芽孢杆菌 (RNAP-HelD)。 黑点表示使用野生型HelD获得的数据,品红色点表示使用HelD K239A获得的数据。 右图显示了野生型HelD,HelD K239A和BSA(阴性对照)的ATPase检测。 误差线,SD。 每个实验重复进行三遍。 源数据在源数据文件中提供。 b, c RNA延伸复合物(EC)的低温EM重建。 电子密度图是半透明的,其颜色与卡通结构中的亚基相同:αI米色,αII棕色,β天蓝色,β'黄色,ω浅绿色,模板DNA紫色,非模板DNA粉红色和RNA橙色。 虚线圆显示了βln5插入,ε结合位点的位置(b)和βE696-G705插入(c), 分别。 RNAP的上游和下游侧显示在 c. d 顶部显示彩色核酸的示意图,如面板所示 bc。 +1代表位于活性位点内的模板DNA核苷酸。 +整数表示在RNAP下游侧与DNA碱基配对的核苷酸,-ve整数表示在上游侧的DNA-RNA杂种。 箭头表示图板下部区域中RNAP活性位点中未配对的+1个核苷酸的位置。 分子间键(极性和非极性)由虚线表示。 相关模板(t)和非模板(nt)核苷酸均已适当编号,并以RNAP亚基为前缀显示氨基酸。 催化镁2+ 离子显示为绿色球体,以指示活性部位。 e EC的上游侧靠近RNA出口通道入口的放大图。 βR800和β'D245之间形成的盐桥显示为黑色虚线。 β'盖下方的空间可以容纳9个th DNA-RNA碱基对显示为虚线矩形,β'方向舵有助于将RNA引向β'盖和RNA出口通道。

    表1 Cryo-EM数据收集,细化和验证统计数据。

    尽管对细胞裂解液进行了核酸酶处理,但在核心结构进行3D重建后,仍清晰可见核酸,表明在整个纯化过程中,核心酶仍与核酸紧密结合,从而保护了核酸免于核酸酶处理(补充表) 1)。 因此,给出的结构代表了具有未指定核酸序列的延伸复合物(EC)(即,重建的密度显示了定义良好的核糖磷酸基团,平均随机碱基序列)。 通常,核心细菌RNAP的亚基组成表示为α2ββʹω,但在先前的工作中,我们发现了一个名为ε的小亚基存在于 枯草芽孢杆菌 除ω以外的RNAP19。 但是,本研究中使用的菌株(LK637,Δδ;方法)制备的全酶缺少ε(补充图。 1a),因此呈现出缺少该亚基的核心结构(尽管ε存在于与HelD结合的RNAP核心结构中,请参见下文)。 先前的研究还显示ε的缺失不会导致可检测的表型或基因表达谱的变化,并且缺少ε的RNAP核心制剂与含有ε的RNAP核心制剂没有区别19,20。 EC和RNAP-HelD复合物的比较表明,在ε结合的区域没有明显的结构差异,因此在图XNUMX中。 1b ε结合位点用虚线圆表示,并在补充图中。 4a 显示ε是因为很明显从 枯草芽孢杆菌 是核(α2ββ'ω)±δ,ε和HelD,以及多个不同的σ因子21.

    EC为150Å×112Å×123Å(长×宽×高,表 1),与其他物种的核心/延伸复合物的尺寸(157×153×136Å; E。大肠杆菌 6ALF,183×107×115Å; 耻垢分枝杆菌 6F6W, and 170.1 × 110.1 × 127.8 Å; 嗜热栖热菌 2O5I)22,23,24,尽管它看起来比粗球形的更细长和细长 E。大肠杆菌,并且比 耻垢分枝杆菌嗜热链球菌 由于缺少插入序列而产生的酶(补充图。 4).

    由于RNAP之间高度的序列保守性,EC的整体结构与其他生物体的相似,并且与先前进行的结构/功能研究中使用的同源性模型一致。 枯草芽孢杆菌 核糖核酸25,26,27,28。 但是,建模无法建立β180瓣中〜5个氨基酸的βln2插入的结构。 β2瓣是细菌RNAP保守性最差的区域之一,并且是存在谱系特异性插入的热点17 (补充图 4a)。 与其他细菌RNAP显着不同的唯一其他区域是一个从βE10-G696伸出的705个氨基酸的环,该环从酶的底部伸出(图XNUMXb)。 1c,补充图。 4a)。 细化和构建顺序到生成的密度表示 枯草芽孢杆菌 β2瓣是一个连续的球状结构,与其他革兰氏阳性RNAP(例如来自那些)相比,βln5插入会增加β瓣之间的大小不对称性 耻垢分枝杆菌研究肺结核23,29 (图。 1b,补充图。 4)。 使用DALI进行搜索30 发现没有与βln5插入片段匹配的结构,其功能与大多数其他谱系特异性插入片段相似。

    缺少谱系特异性插入可能有助于解释在基因组中发现的其他亚基 厚壁菌门 例如δ和ε,以及Pei等人的随附论文。31 确定这些亚基的位置。 这项建议可能得到审查的支持 嗜热链球菌 βln10和βln12插入周围的结构,该区域位于非常靠近ε结合位点的区域。 ε叠加到 嗜热链球菌 EC结构显示ε和插入物之间存在空间冲突(补充图 4c)提高了它们发挥类似功能的可能性。 ε的位置也对应于与酶稳定性相关的古细菌和真核Rpo3 / RPB3亚基的结构域(框内插入,补充图。 4a),有趣的是, 枯草芽孢杆菌 (能够长到〜52°C)和嗜热菌 嗜热链球菌 (最高〜79°C)具有位于该区域的连接α的结构元素/亚单元2,β和β'亚基,而嗜温 E。大肠杆菌耻垢分枝杆菌 不要。

    的ω亚基 枯草芽孢杆菌 是67个氨基酸 vs 80个氨基酸的长度 E。大肠杆菌 ω。 主要的结构差异似乎在于缺少C末端的α-螺旋,该螺旋在 E。大肠杆菌 RNAP,但缺乏 枯草芽孢杆菌分枝杆菌属 结构。 与迄今为止解决的所有其他RNAP核心和EC结构一样,由于连接N端和C端结构域的柔性接头,α亚基的C端结构域不可见。

    伸长复合物的详细检查还揭示了与RNA合成机理相关的重要特征。 叉环2(FL2)的密度定义明确,与其在转录气泡下游边缘DNA链分离中的作用一致。 EC活动站点的结构与先前针对该活动报告的站点类似。 嗜热链球菌E。大肠杆菌 电子商务22,24 (分别为2O5I和6ALF),并且处于与+3位点相邻的RNA转录物1'端的易位后构象,且桥中没有弯曲的桥螺旋(BH)和触发环(TL)开放构象(图。 1d)。 此构型与准备通过辅助通道接收传入NTP的延伸复合体一致。

    FL2残基βR498在链分离和形成转录泡之前与非模板DNA链中最终碱基的核糖和磷酸部分相互作用,并且可能起到促进转录泡下游边缘形成的作用(图。 1d)。 +1位点的模板碱基通过与BH高度保守的T794和A795相互作用而保持与传入底物NTP碱基配对的位置,也可以通过将碱基堆叠在-1位来稳定(图。 1d)。 FL496的βR2与新转录本的RNA碱基4和5的磷酸二酯主链相互作用(图。 1d)。 此外,β亚基的利福平结合口袋的Q469,P520,E521,N524,I528,K924和K932残基与新形成的转录本(RNA 1-5)残基形成许多相互作用。32,33。 βR800和β'D245之间的盐桥关闭了RNA出口通道的主要通道34,35 清晰可见,确认转录气泡上游侧,方向舵和盖子上的有助于模板和非模板链重新退火并引导RNA进入出口通道的元件处于与这些指定角色一致的位置(图。 1e).

    RNA的电子密度超过8th 核苷酸差,阻止了转录本进一步定位到出口通道并通过出口通道。 同样,上游侧DNA的密度定义不佳,与RNAP该区域的构象柔韧性一致26。 结构建模,并与其他生物的EC进行比较22,24这与在上游DNA链重新退火之前转录物包含9 bp模板DNA-RNA杂合体的转录气泡有足够的空间相一致,并且转录物通过与保守的β'盖残基V242和L244(虚线框,图 1e)。 9th RNA-DNA碱基对可能已在复合物制备过程中被核酸酶活性降解。 总体而言,该结构是利用RNA干扰技术进行结构功能研究的宝贵资源。 厚壁菌门 以及作为参考结构,以使我们能够充分了解与HelD结合后诱导的转录复合物回收中所涉及的构象变化(下图)。

    RNAP-HelD转录回收复合物的结构

    RNAP-HelD复合物是从 枯草芽孢杆菌 删除了 脂蛋白 编码δ亚基的基因,先前显示与HelD具有协同作用12 (补充图 1)。 HelD本身是转录复合物回收所必需的,并且可以独立于δ来执行此功能12 在许多包含编码HelD蛋白的基因的生物中是不存在的(例如梭菌)。 纯化的复合物刺激转录约2倍,类似于体外组装的复合物观察到的12,确定其生物学活性(图。 1a).

    我们使用单粒子冷冻电子显微镜(cryo-EM)确定了3.36Å分辨率的RNAP–HelD复合物的结构(补充图。 3),然后进行原子建模(图 2a,表 1; 补充电影 2)。 得到的结构表明,位于RNAP下游侧的HelD具有两个臂结构域,分别深入到RNAP的主要和次要通道中(钳臂; CA和次要通道臂; SCA,分别如图XNUMX所示)。 2a-C),这说明了HelD-RNAP的强大相互作用12,13,36。 天然RNAP-HelD制剂还包含RNAPε亚基19 并显示它结合在RNAP的下游侧,位于两个α,β和β'亚基之间的凹入空间中(图。 2a; 见补充图。 4).

    图2:与HelD复合的RNAP的结构。
    figure2

    ac RNAP-HelD复合物的冷冻-EM重建的不同观点。 电子密度图是半透明的,与图XNUMX中的颜色相同。 1 加上ε绿色和HelD红色。 标记了HelD钳臂(CA),二级通道臂(SCA),1 A躯干和2 A Head结构域,以及RNAP的上,下游侧(a)。 在β和β'亚基之间形成的主要通道显示在 b,并以虚线圆圈表示的辅助频道 a。 面板中视图之间方向的变化 ab 由箭头指示,右侧箭头指示视图中的旋转 a 从α向上2/εend会使β'末端向下移动。 左箭头指示建筑物随后的165°顺时针旋转,以显示 b。 在视图 c 是方向的简单90°旋转 b.

    HelD本身具有不寻常的4结构域结构(图。 3a,b)。 前203个氨基酸(aa)形成二级通道臂(SCA),该二级通道臂与超家族1(SF1)1A域(aa 204–291和539–610)连接。 在SF1解旋酶中,结构域1 A通过插入与解旋酶功能相关的1B结构域进行拆分37,但在HelD中,它由夹紧臂(CA; aa 292-538)分开。 残基610-774形成一个连续的SF1 2 A结构域,通常由SF2解旋酶中的1B插入片段分开,这表示HelD的“头部”。 该蛋白质的整体外观是躯干和头部(分别为1 A和2 A结构域),两侧是一对肌肉臂(SCA和CA),外观相当粗((图XNUMXb)。 3b,c).

    图3:HelD的结构和序列保守性。
    figure3

    a HelD结构的线性表示,带有彩色结构域和保守的序列基序图(上),以及序列同一性的直方图(下图)。 b HelD(底部)的结构根据面板中的示意图着色 a。 SCA显示为黄色,红色显示为SF1解旋酶样结构域1 A,深灰色显示为CA,橙色显示为SF1解旋酶样结构域2A。 保守的序列基序显示为紫色,Walker A / B ATP结合位点显示为青色。 c,显示HelD的表面渲染印象,其颜色与 b。 底图显示了顶图中盒装区域的展开图,该图具有半透明表面和形成“ Trp笼”的保守氨基酸,显示为紫色棒状,而保守Trp以深绿色显示。

    尽管HelD在革兰氏阳性细菌中广泛分布,但独特的臂结构域代表了最低序列保守性区域,尽管它负责与RNAP的大部分相互作用以及其转录回收活性13 (图。 3a,补充图。 57)。 同样清楚的是,至少有两种不同的HelD类(I类和II类,补充图。 5, 6,补充表 2); I类由 枯草芽孢杆菌 蛋白质,并以低G + C革兰氏阳性表达,而II类以 耻垢分枝杆菌 蛋白质(参见Kouba等人的随附论文。38),并且存在于高G + C革兰氏阳性中。 有些生物含有HelD(例如植物乳杆菌一类 文昌野望菜,II类; 补充图 5),甚至在同一生物体内,在SCA和CA结构域中,拷贝之间的序列保守性也相对较低(补充图。 8)。 先前的研究表明,已删除SCA(aa 1–203)的HelD仍然能够结合RNAP,水解ATP和结合DNA,但不能转录回收13。 这些观察结果表明,臂域的功能集中在机械功上,而不是高度保守的功能上重要的蛋白间相互作用的形成。

    尽管清楚地分为两类,但序列比对可以识别所有HelD蛋白共有的保守基序(图。 3a; 补充表 2)。 HelD的转录循环功能取决于ATP水解12,具有位于1 A(躯干)结构域中的ATP结合基序(青色残基,图。 3a,b)。 将Walker A基序中绝对保守的K239更改为A导致转录循环和ATPase活性完全丧失(图。 1a)。 其余的保守基序形成相互作用网络,其主要集中在SCA和1 A结构域之间的区域中,绝对保守的残基W137位于它们之间的疏水口袋中(紫色残基,图XNUMX)。 3a,c)。 这些广泛的相互作用将SCA锚定在1 A结构域上,从而帮助将ATP水解与CA的机械运动耦合(见下文)。

    HelD引起RNAP的主要构象变化

    EC和RNAP-HelD结构的核心元素比较(α2ββ'ω亚基)表明HelD引起主要的构象变化,主要是由于CA打开了β'钳位,而在其他位置几乎没有变化(图XNUMX)。 4a,b; 补充电影 3,请参阅下文)。 比萨39 用于分析RNAP-HelD和延伸复合物中的蛋白质-蛋白质接触(补充表 3)。 与HelD的络合使RNAP亚基β和β'之间的接触面积减少了6%以上,而其他接触面积保持相似,这与HelD结合后对EC造成的广泛构象变化一致。

    图4:HelD诱导的RNAP构象变化。
    figure4

    a, b 低温EM电子密度图(α2RNAP EC(仅ββω亚基)(a)和RNAP–HelD复合体(b)。 为了清楚起见,去除了HelD密度,并且从 E。大肠杆菌 EC(PDB ID 6ALF)叠加在 枯草芽孢杆菌 EC核酸作为视觉构型的视觉辅助,在结合HelD时主要在DNA结合和RNA出口通道中发生构象变化。 核酸的颜色与图XNUMX相同。 1。 来自 E。大肠杆菌 EC有助于说明RNA出口通道孔径的增加。 c 为清楚起见,左侧EC,右侧RNAP-HelD复合物(已清除HelD)被去除,其中显示的β(青色)和βpur(紫色)残基说明了RNA出口通道βR800和β245D242和DNA结合通道βP283和βʹNXNUMX。 左面板中的黑色箭头指示HelD钳臂接触的βʹ钳区域,右面板中的双箭头指示在HelD结合时亚基彼此远离的运动。

    作为转录复合物再循环的一部分,延伸的RNA和DNA模板需要与RNAP分离。 RNA通过RNAP上游侧的出口通道。 除了那些作为β'钳开口的一部分而易位的元素以外,在出口通道的入口处,元素没有发生重大构象变化(图XNUMX。 4)。 β'钳位的移位导致βR800和β'D245之间的保守盐桥断裂,这对于将RNA引导到出口通道中非常重要34,35,将孔的宽度从11增大到20Å(αc–αc; 图。 4c,补充电影 3)。 这种分离以及主要通道的拓宽有助于RNA从复合物中流出。

    HelD对RNAP的最显着影响是将β21瓣P47和β'钳螺旋N2之间的主要通道从242扩大到283Å,这将导致与主要通道中DNA的接触丧失,从而使RNAP得以回收(图。 4b,c)。 CA接近β'钳的SW5区域,这有助于在钳运动期间充当铰链18,40 (补充图 9,电影 3).

    详细检查SCA和CA与RNAP的相互作用,使我们能够定义在转录复合物回收过程中发生的分子事件。 EC中活动位点区域的图像(图 5a),RNAP-HelD复合物(图。 5b)和两个视图的叠加图(图 5c)显示了通过辅助通道插入HelD SCA如何导致桥螺旋和触发环变形以及与核酸的空间冲突。 已知原核Gre因子DksA和真核TFIIS通过一对反平行的α螺旋/发夹环结合在RNAP的二级通道中41,42,43。 这些蛋白质的酸性尖端位于催化Mg的下游,但位于下游2+。 HelD的SCA与GreB / DskA具有表面相似性,但更长,且尖端延伸超过催化Mg2+ (补充图 10)。 酸性尖端(D56和D57)在SCA渗透到活性位点后会静电排斥转录物,当SCA完全插入时,SCA会与转录物和模板DNA链发生明显的空间碰撞。 5c)。 桥螺旋和触发环是动态结构,在转录周期中起关键作用44; SCA进入次要通道会导致EC结构中观察到的开环触发环构象部分折叠,并使桥螺旋发生重大变形,从而与活性位点中的模板DNA发生空间碰撞(图XNUMX)。 5a-C; 补充电影 3)。 因此,SCA尖端本身及其在桥螺旋中的插入插入引起的变形将导致模板DNA和RNA从RNAP的活性位点发生物理置换,这是由于酸性SCA尖端残基与蛋白质之间的静电排斥而促进的。成绩单。

    图5:HelD与RNAP的相互作用。
    figure5

    a EC的活动部位区域的视图,蓝绿色为桥螺旋,黄色为触发环,紫色为模板DNA链,橙色为RNA。 b RNAP-HelD复合物的活性位点区域与HelD的SCA的相同视图以红色显示,酸性D56和D57残基显示为棒状。 c 图中所示区域的叠加 ab 将SCA插入红色箭头指示的辅助通道中。 EC元件显示为半透明,且核酸按图XNUMX中的方案着色。 1。 显示了由SCA扭曲的桥螺旋和触发环元素,黑色箭头指示了从EC到HelD复合体的移动方向。 催化镁2+ 离子显示为绿色球体。 d SCA(红色半透明卡通,紫色棍棒)尖端与RNAP之间存在氢键和盐桥相互作用(蓝色虚线)。 亚基着色与图XNUMX相同。 1。 螯合催化镁的保守活性位点Asp残基2+ (绿色球体,灰色虚线)也显示了说明SCA笼的尖端如何但不与RNAP催化中涉及的残基直接相互作用。 右侧的放大框对应于左侧整个整体显示的框出区域。

    SCA完全插入的尖端非常靠近绝对保守的活性位点β'447NADFDGD453,围绕该基序形成相互作用的网络,但不与催化的镁直接相互作用2+ 或协调它的Asp残基(图。 5d,补充表 4)。 因此,在HelD解离后,核心RNAP将具有在转录中重复使用的能力,如在图XNUMX的转录循环测定中所见。 1a。 最后,将SCA插入辅助通道将阻止NTP进入活动站点。

    补充表中列出了CA用β'夹形成的盐桥和H键接触 4,但大部分相互作用是由疏水残基进行的,即使在密切相关的属之间也几乎没有序列保守性(补充表 5,补充图。 6a)。 该区域是插入的位置,该插入跨主要通道向II类HelD蛋白中的活性位点延伸(参见Kouba等人的随附论文。38; 补充图 6b)。 此插入的尖端与SCA的SCA尖端的位置相似 枯草芽孢杆菌 I类HelD也是酸性的,这表明核酸的静电排斥在II类HelD的活性中也很重要。 在我们的I类HelD结构中,此插入的位置接近于cryo-EM重建中的密度区域,该区域在低阈值下可能与核酸的存在一致(补充图。 11)。 对HelD表面电荷的检查显示,CA内部存在高整体正电荷的区域。 与来自EC的核酸重叠显示,该带正电荷的贴片处于可以与下游dsDNA相互作用的位置(补充图。 11a),与核酸结合数据一致13。 此修补程序也可能与与δ的非结构性负电荷C末端结构域相互作用非常重要,后者在转录复合物回收过程中与HelD协同作用12 (请参阅Pei等人的随附论文。31)。 CA的末端形成一个相对平坦的〜320Å2 表面充当平台以向上推抵靠β'钳,导致与EC中结合的DNA失去接触(图XNUMX和图XNUMX)。 2a-C, 4,补充电影 3)。 因此,CA的目的似乎涉及通过蛮力打开β'钳位,而不是通过形成特定的保守相互作用网络。

    HelD夹臂的运动驱动RNAP的构象变化

    使用3D变异性分析(3DVA)仔细检查RNAP–HelD复合体45 允许鉴定构型柔韧性区域,这些构型区域支持转录回收中HelD活性的动态过程。 总体而言,SW5后面朝向α二聚体的区域(包括次级通道和HelD的SCA)显示很少或没有显示

    构象变异性,但包含β1和2瓣的主要通道以及β'钳位确实存在(图。 6a,补充电影 4).

    图6:RNAP-HelD复合物的3D变异性分析和HelD催化的RNAP回收模型。
    figure6

    a, b 3DVA确定的最独特构象的不同方向。 HelD以纯色显示,RNAP半透明。 HelD的红色构型与RNAP的浅绿色构型相匹配,紫色的HelD与黄色的RNAP相匹配。 橙色箭头指示HelD并列区域的移动,而RNAP指示青色箭头区域的移动。 文中提到的RNAP的结构元件以及RNAP的上(UP)和下(DOWN)侧均已标记。 c HelD催化回收的模型。 HelD以红色显示,RNAP以白色显示,DNA以紫色(模板)和粉红色(非模板)显示,RNA以橙色显示。 从左上方顺时针旋转; HelD找到一个停滞的EC,并与SCA结合,穿透第二通道,CA进入β'钳位。 SCA扎在RNAP的深处,并通过与1 A躯干域的保守相互作用将HelD锁定在适当的位置。 CA用β'钳进行接触,打开DNA结合通道和RNA出口通道,使核酸从EC上解离,可能是DNA与HelD CA上带正电荷的斑块相互作用所辅助。 通过ATP结合/水解(ATP闪烁)促进的构象变化促进HelD(和核酸)解离。 最后,从复合体释放的核心RNAP可以自由进入新的转录周期。

    3D变异性分析表明HelD导致β'钳夹打开并扭曲,因此RNAP的下游侧略微打开(弯曲的青色箭头,图XNUMXb)。 6a)。 同时,β2瓣向上移动(青色直箭头,图XNUMX)。 6a)以及β1瓣和β瓣的轻微扭转(图。 6a,补充电影 4)。 就HelD而言,与RNAP活性位点相邻的SCA尖端没有变化,但是位于次要通道外侧的部分向β'颌骨有横向运动(图。 6b)。 这导致保守的W137残基周围的疏水“笼”几乎没有构象变化。 因此,躯干(1 A)结构域和ATP结合位点的变化相对较小,但头部(2 A)结构域从RNAP的下游侧移开(弯曲和橙色直箭头)。 6a,b, 分别)。 HelD的CA略微上升和上升,导致β'钳下游侧的向上扭曲(橙色箭头,图XNUMX)。 6a; 补充电影 4)。 因此,3D变异性分析的结果与SCA充当楔形物(通过楔子通过CA的运动进行构象变化)一致。 CA位于与SF1解旋酶1B结构域等效的位置,该结构域利用ATP水解进行解旋酶/转运酶活性所需的构象变化46,47 并需要ATP结合/水解才能释放HelD(请参阅Kouba等人和Pei等人的随附论文。31,38),最有可能是由于CA臂的移动,与在该区域观察到的构象柔韧性一致。

    在我们的结构中,以及Pei等人所附论文的结构。 并且Kouba等人,即使在添加ATP或不可水解的类似物时,也不能在ATP结合位点检测到任何NTP的密度。 为了结合ATP,结构域1 A(躯干)和2 A(头部)需要旋转打开,就像SF1解旋酶一样48。 我们的3DVA表明,这很可能是通过2 A(头部)结构域的运动来实现的(图XNUMX。 6a,b)。 但是,将SCA与183A(躯干)结构域连接的F190-G1序列在空间上阻碍了对ATP结合位点的访问,并且该``门''区也需要打开以允许ATP结合和随后的ADP释放(补充图 12)。 残基T185-I189与SCA或IA(躯干)结构域之间不存在分子内键合,这可能为栅极打开和关闭提供必要的灵活性。 假定在所有迫使打开RNAP的DNA结合钳的结构中ATP结合位点均不可访问,则打开门可能是在核酸释放和RNAP回收期间CA构象变化时发生的事件。

    资料来源:https://www.nature.com/articles/s41467-020-20157-5

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